什么是數(shù)字PCR？

數(shù)字PCR是一種新的定量PCR，通過對PCR反應物進行有限稀釋，隨后在不同的反應腔室里進行PCR擴增，后根據(jù)泊松分布原理及陽性微滴的個數(shù)與比例得出靶分子的起始拷貝數(shù)或濃度的技術。

什么是多重PCR？

多重PCR又稱多重引物PCR或復合PCR，它是在同一PCR反應體系里加上兩對以上引物，同時擴增出多個核酸片段的PCR反應；由Chambehian'于1988年*提出,其反應原理，反應試劑和操作過程與一般PCR相同。理論上只要PCR擴增的條件合適,引物對的數(shù)量可以不限,但由于各種條件的限制,實際能夠擴增的引物對數(shù)量是有限的。

什么是多重數(shù)字PCR？

多重數(shù)字PCR是在同一數(shù)字PCR反應體系里加上兩對或兩對以上引物，同時擴增出多個核酸片段的數(shù)字PCR反應。將多重PCR技術與數(shù)字PCR技術有機結合而形成的多重數(shù)字PCR，根據(jù)DNA探針不同熒光度、DNA擴增不同循環(huán)數(shù)及多種標記熒光同時使用，便可大幅提高數(shù)字PCR多重性，多重性可達20-50以上，即同時在一個PCR反應單元內(nèi)進行20-50個以上的數(shù)字PCR反應。

多重數(shù)字PCR在醫(yī)學檢測中的優(yōu)勢

在數(shù)字PCR中實現(xiàn)多指標的并行檢測能顯著降低檢測成本，獲取更豐富的檢測信息。在一個PCR反應中完成基因多個突變位點的檢測，即一個PCR反應即可完成一個Panel的檢測，在醫(yī)學領域有著不可替代的優(yōu)勢。

其優(yōu)勢可以簡單概括為以下三點：

1高效性。
在同一PCR反應管內(nèi)同時檢出多種核酸片段，或?qū)τ卸鄠€型別的目的基因進行分型，特別是用一滴血就可檢測多種病原體。

2系統(tǒng)性。
多重數(shù)字PCR很適宜于成組核酸片段的檢測，如肝炎病毒，腸道致病性細菌，性病，無芽胞厭氧菌。

3經(jīng)濟簡便性。
多種核酸片段在同一反應管內(nèi)同時檢出，節(jié)省時間、試劑耗材和經(jīng)費，為臨床提供更多更準確的檢測信息。

多重數(shù)字PCR的檢測類型

數(shù)字PCR的多重檢測主要通過以下兩種方式實現(xiàn)：

1、多個熒光通道。使用多種熒光染料來標記不同的要檢測的靶基因。

2、單波長多強度。使用一種熒光染料，但是擴增結束時不同的靶基因?qū)娜玖系臒晒鈴姸炔灰粯印?/p>

多重數(shù)字PCR在臨床領域的應用舉例：

1.多重數(shù)字pcr技術檢測肺癌EGFR基因突變

來源：Mol Med Rep.2017 Aug;16(2):1157–1166

EGFR基因突變位點的檢測是指導非小細胞肺癌患者臨床用藥的依據(jù)。其中常見的是21號外顯子L858R突變，19號外顯子缺失以及20號外顯子T790M突變。但是臨床樣本往往是有限的，尤其是液態(tài)活檢樣本，因此多重檢測可以節(jié)省大量檢測樣本及檢測成本。

2，多重數(shù)字pcr技術在染色體非整倍體篩查中的應用

來源：Analyst.2019 Mar 25;144(7):2239-2247

High-Precision Chromosomal Copy Number Measurement using RainDrop®Digital PCR Application Notes

數(shù)字PCR技術具有單分子靈敏度和定量的能力，能夠區(qū)分微小差異，很適合用來進行無創(chuàng)產(chǎn)前檢測。由于胎兒游離DNA占孕婦外周血中游離DNA很小一部分，常規(guī)實驗一對引物探針要想準確分辨胎兒染色體倍數(shù)需要提高足夠多的模板（約41-252ng，胎兒DNA比例10%-4%），這么大量的DNA臨床一般無法提供(1ml血常規(guī)只能獲得1-7ng cfDNA)，這時通過多重數(shù)字PCR設計40對引物和2個通用探針擴增21號和18號染色體上的各20個片段，就能很好的解決這個問題。結果顯示以10ng cfDNA作為起始模板，使用多重數(shù)字PCR技術能夠準確性分辨21-三體綜合征。

3.探針成本太高，沒關系我們用染料法也可以做多重數(shù)字PCR

來源：Anal Chem.2013 Dec 3;85(23):11619-27

通過改變擴增產(chǎn)物的長度，或者調(diào)整引物的量，或者改變反應的Tm值等條件，可以輕松嘗試多重數(shù)字PCR反應。

4.染料法也可以檢測點突變

染料法也可以檢測SNP點突變，通過在上游引物末端添加一段序列，改變突變型或野生型擴增產(chǎn)物長度即可輕松實現(xiàn)多重檢測。

 1.儀器的檢測通量（Throughput）
    首先要考慮實驗室目前需要使用定量PCR儀的頻率。加州大學舊金山分校癌癥中心的基因組分析設備負責人David Ginzinger檢測過市面上絕大多數(shù)的定量PCR儀。他表示，如果不是大規(guī)模批量使用，比如說主要是用來檢測驗已知基因，那確實不需要昂貴的產(chǎn)品。但是如果是那些需要尋找新藥靶點和疾病標記的實驗室，就需要能容納384孔板、運行時間更快的儀器。不過僅有這么一件高通量的儀器是不夠快的，你會發(fā)現(xiàn)樣品制備成為限速的瓶頸。所以高通量的實驗室往往需要進一步的自動化儀器，只要“按一下鈕”，儀器就會自動處理樣品、純化核酸和制備PCR模板。
 
   2.多重擴增的能力 
    多重擴增越來越熱。實時定量PCR儀也不能幸免。定量PCR儀擁有多個檢測通道，因而儀器就可以檢測同一個樣品槽里多個模板的擴增過程。新的LightCycler2.0 有6個檢測通道，比原來多了3個。SmartCyclerⅡ有4個檢測通道。以文庫產(chǎn)品而名滿天下的Stratagene也有一種價格不到Roche的一半、口碑不錯的定量PCR儀Mx3000P，也就是4個檢測通道。不過多重擴增并非人人適用，因為它使實驗復雜化了。
 
  3．軟件 
     當你準備選擇一臺定量PCR儀，你必須要檢測附帶的軟件。使用方便嗎，是否可以進行你所需要的分析，輸出格式有幾種。不過，你需要留意，太容易使用的軟件是不是功能比較簡單而無法進行復雜計算，以前的軟件還需要你做進一步分析，新的軟件已經(jīng)可以處理一切了。除了基本功能，部分軟件還可以有更多的功能，比如引物和探針設計、多重分析設計、背景校正、數(shù)據(jù)歸一化等等。Roche應用科學部的應用和技術服務部負責人Willian Demyan 就強調(diào)：定量PCR是一個幾何擴增的過程，開始時一個拷貝之差，結果就有幾何數(shù)量級之別。
 
    4.靈活性 
    大規(guī)模繁忙的實驗室設備*固然令人羨慕，常規(guī)的實驗室同樣可以有精彩的選擇。現(xiàn)在的供應商都擁有眾多的技術專家，不單了解你的目前需要，還非常周到地為你考慮了以后可能的需求變化，比如提供多種可升級配件和模塊。BioRad的MyCycler就可以選擇模塊而升級為實時定量。ABI的定量PCR儀有多種不同的樣品槽，可以將96孔槽變?yōu)殡p384孔槽而滿足部分高通量的需求。對于剛開始小量做qPCR的實驗室來說，SmartCyclerⅡ定量PCR儀是一個好選擇，一個基本模塊有16個獨立控溫樣品槽，可以同時或者前后分別進行16個*獨立的不同實驗， “隨機存取”；當實驗室需要較大規(guī)模實驗時，可以非常經(jīng)濟地升級，從1個增加到6個基本模塊，也就是96樣品孔。雖然不能用96孔板，但是當一個學生開始小量實驗，其他人還可以隨時插進去開始自己的獨立實驗，而且互不干擾，就是增加了靈活性。對于剛開始只做少量實驗而且預算較緊張的實驗室來說是非常靈活的選擇。
 
    5.不確定性 
   盡管軟件可以做部分修正，購買一臺系統(tǒng)誤差較少的儀器，無需那么多計算修正總比靠計算修正好。Cinzinger 就認為，要特別注意儀器樣品孔之間的差異性。除了*的樣品孔之間的溫度差異，還有樣品孔和檢測探頭之間光程距離、負責收發(fā)和傳遞信號的光纖長度的微小差別、透鏡和樣品孔間的距離和角度的微小差別、甚至樣品槽對信號傳遞的影響。Cinzinger在絕大多數(shù)的市售的定量PCR儀做過同樣的測試，他將同樣的樣品和反應試劑在儀器的每一孔進行實時擴增。很不幸，很多時候，不同樣品孔之間會有不同的結果。